微生物纯培养分离技术

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获得纯培养物对微生物学研究至关重要。

纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。

菌种的分离纯化

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大肠菌种的培养鉴定

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菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的。

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注：
1.乳糖胆盐液体培养基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和胆盐组成，属液态、鉴别、增值、半合成培养液，实验中用于废水中菌群的培养；

2.伊红美蓝琼脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、伊红-美蓝和琼脂。琼脂平板用于分离纯化肠道致病菌，特别是大肠菌群和粪大肠菌群；

3.营养琼脂培养基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂。用于分离纯化后的菌体培养。

实验方法和步骤

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1.实验安排
实验准备；
采样、恒温培养富集及初筛；
观察产气情况及稀释、倒培养基、划线、涂布、倒置培养；
鉴定、接种；
菌种保藏。


2.具体操作步骤


实验准备
①配置培养基(伊红美兰琼脂培养基：7.4g+200mL无菌水、调pH7.2～7.4，营养琼脂培养基：6.6g+200mL无菌水、调pH7.4±0.2,0.85%生理盐水、乳糖胆盐液体培养基2.6g+100mL无菌水，调pH7.4±0.2),，装瓶，高压蒸汽灭菌。

②包扎好培养皿，移液管，试管，进行干热灭菌。

③将配好的乳糖胆盐液体培养基分装入三个试管中，每个大约十毫升，包扎，灭菌。

④液体石蜡和涂布棒等其他实验玻璃器进行灭菌。


采样、培养
取水，湖水，废水三样约2～3滴于3支已灭菌的乳糖胆盐液体培养基试管中，贴好标签（采样时间、人物、温度，采样地点及天气情况），塞好棉塞，于恒温箱（37℃）培养18～24小时；


观察产气情况、稀释
①观察产气管有无气柱，标记阳性管数。
②样品稀释：
对已灭菌的5只试管编号（分别为1、2、3、4、5号），从样液试管取1mL样品液放入盛有9mL生理盐水的试管中为1号试管，换一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀释液。贴明标签。


划线、涂布
①涂布平板法：
将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。


※涂布平板法操作：
1.将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；
2.取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面；
3.将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s；
4.用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。


注意：
1.将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

2.操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。）


②平板划线法：
经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散。在37℃经培养24小时后，可在平板表面得到单菌落。（有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。）


平板划线操作：

鉴定

观察EMB平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，选取符合上述特征的单个菌落进行革兰氏染色，镜检（油镜）观察是否为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。

 

培养

a.将菌落转入装有玻璃珠的灭菌锥形瓶中调节酸碱度为7，充分摇匀备用。

b.液体发酵：取处理好的样品液1mL加入灭菌的乳糖胆盐液体培养基中。摇匀后置培养箱中37℃培养24小时

 

菌种保藏

①斜面低温保藏法：

此法为最常用的一种。一般霉菌；放线菌和有芽孢的细菌可保存2～4个月，酵母菌可保存2个月，无芽孢的细菌最好每周移接一次。操作过程如下：

a.接种：将要保藏的菌种接入斜面培养基上，试管上贴好标签，写上菌种名称，时间。

b.培养：各类菌按其所需温度和时间进行培养。

c.保藏：选取生长健壮的菌种，于其试管带棉塞的上半部用灭菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染杂菌。置于4℃冰箱中保藏。

 

②液体石腊保藏法：

此法可用不分解石腊的菌种保藏。保存时间是半年至一年。放线菌；霉菌和产芽孢菌可保藏二年。液体石腊可防止培养基水分的蒸发，而引起的菌种死亡。同时可阻止氧气进入，防止好氧菌的生长。从而延长菌种保藏的时间。但需注意的是试管必须直立放置，并且不便携带。操作过程如下

a液体石腊的灭菌：将液体石腊装入锥形瓶中，量不超出锥形瓶体积的1/3，塞上棉塞，包扎好后，进行高压蒸汽灭菌二次（120℃30分钟）。再在110～120℃干燥箱中蒸发掉蒸汽灭菌时带入的水分。此时石腊透明清亮状。经检验确定无菌后备用。

b菌种培养：将所需的菌种经培养后，选取健状的保藏。

c加石腊油：用无菌管吸取石腊油加入菌种试管中，以高出菌种斜面顶点1cm为宜。少了会因培养基露出油面，而使培养基变干造成菌死亡。

d 收藏：试管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4℃。

e 恢复使用：当要使用菌种时。倾出石腊油。此石腊油可再灭菌重复使用。接种培养。由于菌体外粘有油。第一次的菌生长缓慢，性状恢复不是很好。所以要再移植一次才能得到良好的菌种。

小结

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此外，实验结果记录应包括：

1．观察记录乳糖胆盐培养基产气情况。

2．观察EMB培养基上菌落（包括：形态，质地，色泽，上述实验方案中有具体说明。）

3．记录镜检结果。